Produção de Scaffolds para Regeneração de Lesões Cutâneas

PRODUÇÃO DE SCAFFOLDS A PARTIR DO POLI(ACIDO LÁCTICO-CO-GLICOLICO) PLGA INCORPORADOS COM ÓLEO NATURAL DO GÊNERO COPAIFERA SP. PARA REGENERAÇÃO DE LESÕES CUTÂNEAS

Ana Luiza Garcia Millas1,2*, Joao V. W. Silveira1, Robert Stevens2,3, Robert Mckean3, Ann Kramer3, Edison Bittencourt1

1Departamento de Engenharia de Materiais e Bioprocessos /UNICAMP, Campinas/SP, ([email protected]).
2Nottingham Trent University, School of Science & Technology, Nottingham, NG1 4BU,UK.
3The Electrospinning Company, Rutherford Appleton Laboratories Harwell, Oxford Didcot, OX11 0QX, UK.

Resumo: O objetivo deste trabalho foi desenvolver um scaffold bioativo sintético e biodegradável que sirva como substituto dérmico de queimaduras graves. O primeiro critério é que esse biomaterial não cause reações adversas como respostas inflamatórias crônicas, permitindo que as células se proliferem, migrem e se diferenciem por todo o scaffold, e ainda, propicie a vascularização do tecido. A técnica adotada para a produção desse material foi a eletrofiação, a partir do copolímero poli(acido láctico-co-glicólico) PLGA (50:50) nas concentrações de 7.5%, 10%, 12.5% e 15% (p/p), dissolvido em 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP). Também foram adicionadas concentrações de 10% de óleo de Copaíba (gênero Copaifera sp.) as soluções pré-eletrofiadas. Esse é um óleo natural, proveniente da região amazônica com comprovadas propriedades cicatrizantes, analgésicas e antimicrobianas. Diferentes diâmetros e porosidades foram obtidos, a fim de se determinar a morfologia mais apropriada para a adesão, proliferação e diferenciação celular. Para a identificação da biocompatibilidade das fibras foram realizados testes in vitro utilizando fibroblastos e a caracterização foi feita por microscopia eletrônica de varredura.

Palavras-chave: Poli(acido-láctico-co-glicólico), scaffold, Copaifera sp., queimaduras, fibroblastos.

Introdução

Na natureza as estruturas mais complexas e de maior perfeição estão nano- e micro-metricamente arquitetadas. O papel da biomimética é justamente desvendar esses segredos e tentar mimetizá-los, partindo da observação e do entendimento das suas formas e biogênese [1]. Esse ramo das ciências tem crescido mundialmente e está se tornando um dos pilares de maior interesse de áreas como a biologia, as engenharias e a medicina.

Este projeto se propõe a estudar a biomimética no âmbito do maior tecido dos vertebrados, a pele. Constituída de três camadas, a epiderme, a derme e a hipoderme, a sua estrutura é bastante complexa. A epiderme,camada superficial e mais fina, com alta densidade celular, é constituída principalmente de queratinócitos e melanócitos, funcionando como uma barreira vital. A derme situada logo abaixo da epiderme é conhecida como a camada mássica da pele, composta principalmente por colágeno, elastina e glicosaminoglicanas (GAG’s). Os fibroblastos são o tipo celular prevalente na derme e produzem enzimas de remodelagem como proteases e colagenases, que desempenham importante papel no processo de cicatrização. A derme, é importante na proteçãobiomecânica da pele. A hipoderme, camada mais interna é bastante vascularizada, constituída principalmente de tecido adiposo, que contribui para a regulação térmica e também para a proteção mecânica [2].

O organismo além de células é constituído de espaços extracelulares, preenchidos por uma extensa rede de macromoléculas que formam uma estrutura fibrosa composta de colágeno, elastina, proteoglicanas, proteínas especializadas na adesão celular, como as fibronectinas, a laminina, etc [3]. Os colágenos tipo I e tipo III são os principais constituintes da matriz extracelular da pele, pois promovem resistência mecânica, transmitem e dissipam cargas, ajudam a manter a estrutura do tecido, além de compartimentarem as células e tecidos em unidades funcionais, agindo como suporte tridimensional celular e vascular [4,5]. Shi D. [3] chama essas estruturas extracelulares de materiais bio inspirados.

Injúrias de pele, queimaduras e cicatrizes representam um dos maiores custos mundiais na área da saúde. A criação in vitro de substitutos da pele tem sido o foco de pesquisas nos últimos 30 anos e concomitantemente a isso o conhecimento sobre o comportamento celular e sobre a patobiologia de lesões crônicas tem crescido [6]. Há algumas alternativas atuais para substitutos de pele, mas nenhuma delas atente a 100% da demanda e das necessidades para uma boa cicatrização.

Como observado por Borojevic e Serricella [7] lesões extensas de pele são seguidas de distúrbios graves, freqüentemente fatais, e requerem intervenção urgente visando a restituição da sua integridade. O caso de queimaduras graves, tanto térmicas quanto químicas, é um exemplo típico e freqüente dessas lesões, pois essas queimaduras destroem a epiderme, a derme e os tecidos subcutâneos e representam um problema muito mais complexo, já que a regeneração espontânea da pele não é mais possível.

Os biomateriais têm sido largamente utilizados em sistema diagnósticos e terapêuticos [8,9], de natureza natural ou sintética, podem ser usados temporária ou definitivamente, com a finalidade de melhorar ou substituir, parcial ou totalmente, tecidos ou órgãos. Muitas vezes é interessante que esses biomateriais possuam uma matriz tridimensional e nano- ou micro-metricamente arquitetada para aumentar a interação entre as células e tecidos [10] e otimizar o papel como carreadores de funções biológicas que ocorrem em escala molecular com auto grau de especificidade [11]. O primeiro objetivo da engenharia têxtil é simular a matriz extracelular [12].

Uma técnica ainda incipiente no Brasil e mais conhecida como electrospinning, a eletrofiação tem recebido bastante atenção, primeiramente pela facilidade em se produzir fibras ultrafinas, com alta razão de aspecto superfície/volume sem a necessidade de uma instrumentação cara e complexa [13]; segundo por se aplicar a uma grande variedade de polímeros, naturais e sintéticos; e terceiro pela possibilidade de se controlar o diâmetro, a disposição aleatória ou alinhada dos filamentos, a porosidade e a topografia das fibras, variando-se as condições do processo (equipamento) e da solução polimérica [14].

Como afirma Zeltinger J. et al. [15] a alta razão de aspecto superfície/volume, combinada a estrutura porosa das fibras fornece espaço suficiente à acomodação, proliferação, migração e diferenciação celular, além de aumentar a eficiência no transporte de nutrientes e excreção de metabólitos entre a matriz da fibra e o ambiente externo. Essas características morfológicas são semelhantes a matriz extracelular dos tecidos naturais, que tem uma larga faixa de distribuição de poros, alta porosidade, propriedades mecânicas efetivas e propriedades bioquímicas específicas.

Nesta pesquisa o copolímero poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) foi selecionado por ter boas propriedades mecânicas que suportam tanto o manuseio pré-implante, quanto a morfogênese celular, pós- implante. O PLGA é um copolímero sintético, biodegradável e biocompatível, aprovado pelo órgão regulamentador Food and Drug Administration (FDA) para uso em humanos e já utilizado na área da medicina como implantes internos e suturas [16]. No corpo é degradado em ácido láctico e glicólico via hidrolise das ligações ésteres [17-19].

Nos últimos anos aumentou o número de pesquisas que buscam funcionalizar ou tornar esses scaffolds bioativos, seja através da adição de biomoléculas, como, fatores de crescimento [20] e genes terapêuticos [21] que agregam as propriedades físicas desses biomateriais às propriedades biológicas desses compostos, seja através da técnica de eletrofiação coaxial [22], onde dois ou mais componentes podem ser eletrofiados por diferentes canais de capilaridade e exercerem sinergicamente suas funções.

Foi pensando na produção de scaffolds bioativos que a idéia desse projeto se construiu. Considerando que o Brasil é reconhecido internacionalmente por possuir a maior reserva florestal diversificada do planeta e ciente do potencial da sua flora para o uso na medicina que o óleo de copaíba da espécie Copaifera landesdorffi foi criteriosamente selecionado. Esse óleo natural tem comprovadas ações terapêuticas, agindo como cicatrizante, analgésico, antiinflamatório e antimicrobiano [23-25], além disso, é aprovado pelo FDA. Esse projeto se propôs a incorporar o óleo de copaíba nas fibras produzidas, para futuramente utiliza-las como scaffolds para a regeneração de queimaduras graves. Esse trabalho já foi iniciado pelo grupo e desencadeou depósito de patente pela INOVA/UNICAMP.

Além das requeridas propriedades medicinais desse óleo, em trabalhos anteriores o grupo demonstrou que adicionado às soluções pré-eletrofiadas, melhoram as propriedades de viscosidade, condutividade e tensão superficial, facilitando o processo de eletrofiação e a produção de fibras mais homogêneas e regulares.

Ainda é incipiente o que existe de trabalhos científicos sobre esse óleo [26]. A maior parte das publicações são ensaios empíricos baseados no dito popular [27]. Sobre óleos incorporados a nanofibras, há uma patente depositada em 2009 (Ref. WO2009/045042 A1) [28] que não cita o gênero aqui proposto. Portanto, esse trabalho ajudará a avaliar as propriedades antiinflamatória, analgésica, cicatrizante e antimicrobiana do óleo de copaíba [29],quando incorporado aos scaffolds.

Parte Experimental

O método empregado para a produção das nanofibras foi a técnica de fiação eletrostática, ou electrospinning. O equipamento consiste em uma bomba de vazão controlada de deslocamento positivo, uma caixa de acrílico para ajudar no isolamento elétrico, na proteção a solventes fortes e na relativa esterilidade dos materiais, um anteparo rotativo de alumínio para a deposição das amostras, uma fonte de alta tensão com voltagem controlada de 0-30KV e um controlador de umidade e temperatura.

O poli(ácido lático-co-glicólico) na composição 50:50 (Purac/Purasorb) foi dissolvido em 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) (Sigma aldrich) nas concentrações de 7,5%, 10%, 12,5% e 15%(p/p). Foi adicionada concentraçao de 10% de óleo de Copaíba (Copaifera lagsdorffii) (Magispharma) a solução de 12,5%(p/p) de PLGA. A distancia da ponta da agulha ao coletor foi de 30cm, voltagem aplicada de 11kVe vazão da seringa de 0,8mL/h.

A caracterização quanto a morfologia das fibras: tamanho e distribuição de diâmetros e porosidade foi feita em microscópio eletrônico de varredura (Phenon G2).

Ensaios in vitro (biocompatibilidade)

Os testes in vitro para biocompatibilidade do material foram realizados no Laboratório de Cultura Celular do Research Complex no Science and Technology Facilities Council (STFC) em Harwell, Inglaterra, onde foram utilizados fibroblastos de pulmão de linhagens imortalizadas. Os cultivos foram feitos em frascos (garrafas) de poliestireno estéril (50ml) em meio HAM F-12, da Sigma-Aldrich, na proporção de 1:1.

As amostras foram cortadas nas dimensões de placas de 12 poços e adicionadas aproximadamente 4×105 células em cada poço sob o material. As amostras foram incubadas a 37ºC com 5% de CO2 e analisadas em dois pontos, 3 e 6 dias. O meio de cultura foi trocado a cada 24 horas.

Para preparação das amostras para MEV foi seguido método utilizado por Metcalfe et al.[6].

Resultados e Discussão

Fibras com diferentes diâmetros e porosidades foram produzidas utilizando a tecnologia de eletrofiação. Com o aumento da concentração de PLGA na solução os diâmetros e porosidades aumentaram progressivamente e as matrizes também se tornaram mais uniformes (Fig.1):

Fig. 1 – Micrografias (MEV) de fibras de PLGA nas concentrações de 7.5, 10, 12.5 and 15% (p/p) mostrando diferenças no diâmetro e porosidade. (aumento 2.000 x)

Para a realização dos ensaios in vitro, a fibra de PLGA a 12,5%(p/p) foi selecionada. Para tanto fez-se uma comparação entre os diâmetros e porosidades das matrizes com óleo e sem óleo de copaiba (Fig.2). Observa-se uma pequena diminuicao no diâmetro das fibras com o óleo, mas ele se mantem na faixa de 2 a 3µm proposta por Metcalfe [6] para cultivo de fibroblastos:

Fig.2 – Micrografias (MEV) de fibras de PLGA 12.5% (p/p), a) sem adição de oleo e b) com adição de oleo de Copaiba, mostrando o tamanho e distribuição de diâmetros (aumento 2.000 x).

A partir dos resultados obtidos nas micrografias da Fig. 3, após 3 e 6 dias de cultivo celular, pode-se dizer que o material além de biocompatível, se apresentou extremamente eficiente a adesão e proliferação celular por toda a malha da fibra, sugerindo uma formação tecidual tridimensional após 6 dias. A presença do óleo apresentou menor quantidade de células ate o terceiro dia, mas esse quadro mudou no sexto dia, quando a fibra com óleo aparenta ter formado um tecido mais espesso:

Fig. 3- Micrografias (MEV) pós-ensaio in vitro com fibroblastos de pulmão para verificação de biocompatibilidade das matrizes com óleo e sem óleo de copaíba, com 3 e 6 dias de cultivo.

Conclusão

Matrizes fibrosas foram produzidas com sucesso a partir do poli(acido-láctico-co-glicólico) PLGA. Os scaffolds com concentração de 12,5%(p/p) de PLGA foram selecionados para a realização dos ensaios in vitro devido a uniformidade estrutural e a melhor morfologia quanto ao tamanho de poro e diâmetros de aprox. 3µm, características já comprovados em estudos da empresa The Electrospinning Company, da Notthigham Trent University e da Sheffield University [6], na Inglaterra. A uniformidade e as características morfológicas das fibras não apresentaram diferenças significativas quando da presença do. As células aderiram e se proliferaram sob toda a rede, formando uma estrutura tridimensional. Não houve diferenças significativas no crescimento celular entre as fibras com óleo e sem óleo, o que indica que o PLGA e um material biocompativel e que o óleo não causa reações adversas a adesão e crescimento celular.

Agradecimentos

Os sinceros agradecimentos ao Yussef Mohhamed, aluno de pós-doutorado do Prof. Ian Robinson do Research Complex at Harwell (RCaH), Inglaterra, onde foram realizados os ensaios in vitro. Ao Santander, órgão financiador do período em que essa pesquisa foi realizada na Inglaterra. A FAPESP pelo apoio financeiro. E a empresa inglesa The Electrospinning Company, que forneceu toda a infraestrutura e materiais para a produção dos scaffolds.

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