Cromatografia e Cromatograma

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Cromatografia

Método composto por diversas técnicas que tem como objetivo principal a separação e a identificação das substâncias que compõem uma mistura (um óleo essencial, por exemplo).

Como Funciona

Basicamente, pela passagem da mistura por duas fases: uma estacionária (fixa) e outra móvel. A fase estacionária é formada de um material que retém de forma diferenciada os componentes da amostra a ser analisada. Já a fase móvel é o material que se desloca pela fase estacionária, arrastando os componentes da amostra. Então, após “transitar” pela fase estacionária, os componentes da amostra se separam e são identificados pelo sistema detector, do primeiro componente menos retido ao último mais retido pela fase estacionária.

Cromatografia Gasosa e os Óleos Essenciais

É o método que permite analisar misturas de constituintes voláteis termicamente estáveis. É, portanto, a técnica utilizada para os óleos essenciais. Nela, a fase móvel é representada por um gás, o chamado gás de arraste, cujo hélio (He) é o mais empregado. Ele não interage com a amostra, ou seja, apenas faz o papel de “carrier” para carrega-la através da coluna (fase estacionária).

Escrito por Wagner Azambuja
Curso de Aromaterapia

Cromatografia

Cromatografia é o nome do método composto por diversas técnicas que tem como objetivo principal a separação e a identificação das substâncias de uma mistura – de um óleo essencial, por exemplo. Basicamente, ela acontece pela passagem dessa mistura por duas fases: uma estacionária (fixa) e outra móvel. A fase estacionária é formada de um material que retém de forma diferenciada os componentes da amostra a ser analisada. Já a fase móvel é o material que se desloca pela fase estacionária, arrastando os componentes da amostra. Então, após “transitar” pela fase estacionária, os componentes da amostra se separam e são identificados pelo sistema detector, do primeiro componente menos retido ao último mais retido pela fase estacionária.

“A primeira técnica cromatográfica foi inventada por volta de 1900 pelo botânico russo Mikhail Semyonovich Tswet, que utilizou éter de petróleo (fase móvel) através de uma coluna de vidro preenchida com carbonato de cálcio (fase estacionária) para separar os componentes de um extrato de folhas. O método, então, foi apresentado à sociedade no dia 30 de dezembro de 1901, pelo próprio Mikhail, durante o 11º Congresso de Médicos e Naturalistas, em São Petersburgo.”

Cromatografia Gasosa

A cromatografia gasosa é o método que permite analisar misturas de constituintes voláteis termicamente estáveis. É, portanto, a técnica utilizada para os óleos essenciais. Nela, a fase móvel é representada por um gás, o chamado gás de arraste, cujo hélio (He) é o mais empregado. Ele não interage com a amostra, ou seja, apenas faz o papel de “carrier” para carrega-la através da coluna (fase estacionária). Este gás, para poder ser utilizado no equipamento, deve atender a 3 requisitos: 1) deve ser inerte. Isto significa que ele não pode reagir com a amostra, fase estacionária ou superfícies do instrumento. 2) deve ser puro, ou seja, isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária. 3) deve ser compatível com o detector. Por exemplo: no caso do detector de ionização de chama (FID), os gases compatíveis são N2, He, ar e H2. No forno do CG (ou GC – gas chromatography), tem-se a coluna (fase estacionária). Estas colunas podem ser: 1) capilares, onde o diâmetro varia de 0,10 a 0,50 mm, 5 a 100 m de comprimento, feitas de aço ou vidro cuja fase estacionária é depositada como filme aplicado diretamente às paredes do tubo. 2) empacotadas, de diâmetro variando de 3 a 6 mm, com 0,5 a 5 m de comprimento, feitas de vidro ou metal onde a fase estacionária também é depositada como filme, sobre as partículas de um suporte adequado. Sobre o forno, este deve operar em temperaturas de até 400º C, com fácil acesso à coluna (para facilitar a substituição), e, aquecimento e resfriamento rápidos. Aliás, depois de 1980, a temperatura dos fornos em CG passou a ser totalmente controlada por microprocessadores.

Os detectores são os dispositivos que examinam continuamente o material eluido, gerando sinal quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste. Grosseiramente, “geram os picos” do cromatograma. Em CG, os mais importantes são: 1) detector por condutividade térmica (DCT ou TCD); 2) detector por ionização em chama (DIC ou FID), cujos íons são gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de H2 + ar; 3) detector por captura de elétrons (DCE ou ECD), onde ocorre a supressão da corrente pela absorção de elétrons por eluatos altamente eletrofílicos. Destes, o FID é o mais comumente utilizado, porém, não serve para a análise de gases. PS: o usuário deve se atentar para a temperatura do FID, a qual deve estar sempre maior que a temperatura do final da coluna. No caso dos óleos essenciais, além do CG, é importante que se tenha um espectrômetro de massas acoplado, o qual será o responsável por caracterizar as moléculas pela medida da relação massa/carga de seus íons. Trocando em miúdos, é quem permite identificar os compostos desconhecidos, quantificar os compostos conhecidos e, ainda, elucidar estruturas moleculares. Ou seja, grosso modo, o CG é quem faz a varredura na mistura em busca de seus componentes, e, o MS (espectrômetro de massas), é quem faz a identificação destes; ao comparar a relação massa/carga de seus íons com uma biblioteca de moléculas conhecidas. Logo, para as análises de óleos essenciais, onde não existe um “padrão”, o GC-MS – geralmente com detector FID, é o equipamento mais utilizado.

Curso de Óleos Essenciais e Aromaterapia

Basicamente o cromatógrafo de gás é constituído por 5 elementos: (1) a fonte do gás de transporte, num cilindro a alta pressão, munido de reguladores da pressão, (2) os sistema de injeção da amostra, (3) a coluna de separação, (4) o detector e (5) o registrador.

Cromatograma

É o gráfico que “traduz” os resultados da análise cromatográfica, possibilitando assim a leitura e a identificação dos componentes da mistura. Neste gráfico, cada substância é representada por picos – cujo número de picos depende da precisão do cromatógrafo, da finalidade prática do experimento e também, é claro, da complexidade da amostra. É por isso que alguns cromatogramas exibem apenas 3 picos e outros, sobretudo de trabalhos científicos, 100 ou mais para uma mesma amostra. A figura abaixo, por exemplo, representa o cromatograma de um óleo essencial de lavanda (Lavandula officinalis) qualquer. No eixo das abscissas, tem-se o “tempo” (t), em minutos. Então, nota-se que o componente do pico [1] foi a substância de destaque que mais rapidamente surgiu. Por isso, [1] foi a menos retida na fase estacionária, e, portanto, a que possui maior afinidade com a fase móvel. Em contrapartida, [5] foi a mais retida. Tecnicamente, diz-se que [5] é a que tem maior adsorção, logo a que se moveu mais lentamente pela coluna. Já o eixo das ordenadas registra a força do sinal por meio de um impulso elétrico, o qual só faz sentido a partir da calibração do equipamento com uma solução padrão conhecida. No entanto, como os óleos essenciais são misturas complexas, é inviável adquirir e calibrar os equipamentos com todos os padrões, até porque, em muitos casos, nem existe o padrão correspondente. Por esta razão, para estes óleos, aceita-se a análise feita pela “normalização de áreas”, que basicamente faz uma regra de três com a soma da área produzida por todos os picos (exceto o solvente) com a área de cada pico, individualmente. Assim, grosso modo, o eixo das ordenadas é o que representa as concentrações de cada substância numa amostra. Voltando ao exemplo abaixo, vê-se que [2] e [4] são as substâncias que estão em maior proporção no óleo. Além disso, os cromatogramas também devem conter as informações sobre o “método de análise”, que irá especificar o modelo do cromatógrafo, da coluna, do injetor, do detector e detalhes sobre as injeções. Muitas vezes, inclusive, o documento final que é entregue ao solicitante também já contém os nomes dos componentes identificados, algo que só é possível desde que a análise tenha sido feita com um espectrômetro de massas acoplado ao sistema.

De acordo com o cromatograma esta amostra contém:

1 – 3,4% de limoneno, que apresenta atuação terapêutica no tratamento do câncer, protege o tecido pulmonar e tem efeito solvente sobre as células adiposas e colesterol ruim.
2 – 30,9% de linalol, que é bactericida, fungicida, acaricida, ansiolítico (reduz a ansiedade), sedativo e antidepressivo.
3 – 3,3% de cânfora, que é estimulante da pressão sanguínea, anti-séptico e anestésico.
4 – 29,3% de acetato de linalila, que é antiinflamatório.
5 – 16,1% de acetato de citronelila, que é antimicrobiano e bactericida.

A sinergia destes componentes, juntamente com os outros, em quantidades menores, fornecem a atuação terapêutica do óleo essencial de lavanda – que é indicado para contusões, dores musculares, distúrbios gástricos, queimaduras, inflamações provenientes de picadas de insetos, insônia, dentre outros.

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Mostrando 13 comentários
  • Massao Geraldo Alves
    Responder

    De fato, uma técnica fascinante e de suma importância na elucidação da composição dos óleos essenciais. Dois grandes cientistas que se destacam na área são Brian Lawrence e Luigi Mondello.

  • João Freire
    Responder

    Por gentileza, alguém poderia falar um pouco sobre picos ruins? Obrigado.

    • Lucas Pereira
      Responder

      Meu caro, em CG nós temos basicamente 2 tipos de picos ruins, os picos com cauda e os picos com cauda frontal. Os picos com cauda ocorrem quando os componentes são adsorvidos no liner ou na coluna. Isto pode ocorrer, por exemplo, quando componentes polares são analisados com uma coluna de fase líquida apolar (ou vice-versa). Já o problema da cauda frontal ocorre quando a coluna é sobrecarregada com os componentes da amostra, ou, também, quando a temperatura da coluna ou do injetor está muito baixa. Situações de cauda frontal geralmente são mais fáceis de serem resolvidas; quando comparadas à pico com cauda. Lembrando que o detector deve ser limpo de 6 em 6 meses.

      • João Freire
        Responder

        Obrigado pelo retorno! E quais as vantagens das colunas longas?

        • Lucas Pereira
          Responder

          Rapaz, as colunas longas tem maior resolução, porém, com isto aumenta-se o tempo de análise e também são mais caras. Lembrando que a fase estacionária influencia diretamente na retenção da coluna, ou seja, quanto maior a espessura do filme, maior a retenção dos analitos ou vice-versa. Ex: compostos muito voláteis requerem uma fase estacionária mais espessa. Já compostos com alto ponto de ebulição requerem uma FE menos espessa. Ok?

  • Guilherme
    Responder

    Alguém saberia indicar alguns laboratórios que façam análises de CGMS no Brasil? Obrigado.

  • LETICIA MAIARA
    Responder

    ooia boa noite, queria sber se o cromatografo seria em linha e o GNV é único?

  • Raphael Pires Filho
    Responder

    Existe uma lista dos componentes dos óleos essenciais (cromatografia)? Há algum link ou livro?

    • Daiane Barbosa de Matos Lima
      Responder

      Bom dia. Existe sim. O livro de ADAMS. ELE TEM TODOS OS ÍNDICES DE LPTRI DE ÓLEOS ESSENCIAIS.

  • Bruna Terra
    Responder

    neste cromatograma, o pico mais alto seria o que mais intergiu com a fase estacionaria? ou seria o primeiro pico?

  • Wendel
    Responder

    Preciso isolar os compostos majoritário do meu óleo alguém poderia esta me indicando um metodologia ou alguns trabalhos sobre. Meu e-mail: [email protected]

  • Bárbara
    Responder

    Quanto custa uma análise por CG de percentual de ácidos graxos de óleo vegetal?

  • Castro
    Responder

    Vocês disponibilizam as cromatografias dos oléos essenciais comercializadas por vocês?

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